來源：中國科學院理化技術研究所      

醫(yī)療器械產(chǎn)品滅菌的目的，是使產(chǎn)品無任何類型的存活微生物，在滅菌過程中，微生物的死亡規(guī)律是用指數(shù)函數(shù)表示的。因此任何單位產(chǎn)品上微生物的存在可用概率表示，概率可以減少到很低，但不可能為零。該概率可用無菌保障水平(SAL) 表示，通常無菌概念是指無保障水平(SAL) 達到10-6。

醫(yī)療器械滅菌驗證一般分為安裝確認(IQ)、操作確認(OQ) 和性能確認(PQ)。

安裝確認是指：獲得證據(jù)并用文件證明滅菌設備及其附屬設施，已按照規(guī)定的要求被提供和安裝。

操作確認是指：當設備按程序運行時，獲得證據(jù)并用文件來證明已安裝的設備，有能力在指定的允差范圍內提供特定的過程。

性能確認是指：獲得證據(jù)并用文件證明設備能夠在預先設定的參數(shù)下持續(xù)運行，且這個過程加工后的產(chǎn)品是無菌的。性能確認一般包括物理性能確認和微生物性能確認，器械所使用的材料對滅菌方法的適用性，也是性能驗證中的重點。

本文結合國際上最新的滅菌相關標準，介紹了無菌醫(yī)療器械生產(chǎn)的幾種常用的滅菌方法及其驗證要點，如環(huán)氧乙烷滅菌(EO 滅菌)、輻照滅菌、高壓蒸汽滅菌和甲醛蒸汽滅菌等，以供醫(yī)療器械研究和生產(chǎn)單位參考。

1. 環(huán) 氧 乙 烷 滅 菌

20 世紀50 年代起環(huán)氧乙烷(ethylene oxide, EO)開始用于醫(yī)院滅菌。經(jīng)過眾多科學家的研究證明，環(huán)氧乙烷被認為是一種滅菌效果較好的低溫化學滅菌劑，在常溫下即有良好的穿透作用，對物品無損害，而被廣泛用于畏熱、畏濕的醫(yī)療器械產(chǎn)品滅菌中。

1.1 滅菌原理

EO 是一種簡單的環(huán)氧化合物，遇水可形成乙二醇，具有較大的蒸汽壓，對物品的穿透性較強。據(jù)報道，EO5min 能穿透0.1mm 厚的尼龍薄膜，26min 能穿透0.3mm 的氯丁膠布，41min 能穿透0.39mm 厚的丁基橡膠布。

如果要達到一定的滅菌效果，滅菌劑必須充分接觸物品的各個表面，EO 的這種高穿透性大大提高了其滅菌效果。EO 對細菌、芽孢、真菌、立克次體和病毒等各種微生物具有殺滅作用，屬于光譜殺菌劑，其滅菌機理是與細菌蛋白質分子、酶、核酸中的氨基、羥基、羧基相結合，產(chǎn)生烷基化作用，對菌體細胞的代謝產(chǎn)生不可逆的破壞，從而達到滅菌作用。

1.2 滅菌驗證

環(huán)氧乙烷滅菌的驗證包括以下3 個步驟：

安裝確認：一要確認滅菌器隨機文件和附件的完整性，如安裝記錄、圖紙、計算機軟件、計量裝置的校準等，二要對滅菌器工作環(huán)境的符合性進行驗證，如水質檢測、安全要求等，三是要驗證滅菌器安裝是否符合設備安裝要求，要確認滅菌劑的濃度及質量狀況。

操作確認：驗證滅菌設備有能力在指定的允差范圍內提供特定的過程，如溫度分布試驗、濕度分布試驗、泄漏試驗、真空速率試驗、空氣循環(huán)試驗( 如果使用) 等。

性能確認：包括物理性能確認和微生物性能確認。

物理性能確認，應書面證明過程的重現(xiàn)性，并且符合所有指定的可接受參數(shù)。這些過程包括預處理、處理、滅菌和通風階段等，操作重現(xiàn)性確認一般至少需要3 次連續(xù)運行，適當時進行微生物挑戰(zhàn)試驗。環(huán)氧乙烷是致癌物，通風次數(shù)和解析放置的溫度與時長對環(huán)氧乙烷的殘留的影響，也需要作出相應的評價。

微生物學性能驗證，目的是應書面證明在滅菌過程后，產(chǎn)品的無菌性能已經(jīng)達到特定的要求(SAL=10-6)。

微生物性能驗證的方法有：生物負載法和過度滅菌法。

一般情況下，EO 滅菌微生物性能確認均采用生物指示劑(BI，枯草桿菌芽孢)。進行微生物學性能驗證的產(chǎn)品，應采用與其常規(guī)滅菌相同的包裝，生物指示物應放置在被滅菌物品中最難滅菌的部位，并在預處理前就放入選定部位，且在整個滅菌周期保持該位置。

生物指示物監(jiān)測點的數(shù)量應能驗證滅菌器內全部被滅菌物品的微生物滅活，通常滅菌室體積≤10m3時，驗證時至少設置體積V×3 個檢測點，但不少于5 個，日常監(jiān)測至少設置V×1.5 個檢測點，但不少于5 個。

滅菌室體積在>10m3時，驗證時至少設置體積30＋(V-10)×3 個檢測點，日常監(jiān)測至少設置15+(V-10)×1.5 個檢測點。這里還涉及到溫濕度探頭的數(shù)量等要求，不同體積的滅菌器有不同的要求，可查閱ISO 11135-1:2007 附錄C。

由于環(huán)氧乙烷滅菌不存在通用的經(jīng)典滅菌參數(shù)，影響滅菌效果的因素多且相互關聯(lián)，滅菌過程控制復雜，所以為了保證滅菌效果，對其滅菌過程進行嚴格的驗證是必要的。此外，若滅菌設備、被滅菌物品和裝載方式任何一個因素改變時，都需要重新進行驗證。

1.3 產(chǎn)品放行

日常監(jiān)測中，需要監(jiān)測預處理時的溫度和濕度、處理過程中滅菌柜內的濕度和時間、整個滅菌過程的溫度和壓力、環(huán)氧乙烷已注入的證據(jù)、滅菌時間、解析時的溫度和壓力變化。最終只有生物指示物(BI) 培養(yǎng)全部顯陰性且滅菌過程參數(shù)在性能驗證的參數(shù)范圍內，產(chǎn)品才可以放行。

1.4 應用

EO 可用于不耐高溫、不耐濕物品的滅絕，被認為是一種滅菌效果最好的化學滅菌劑，可殺死所有微生物包括細菌以及芽孢。EO 具有極強的穿透性，可用以各種難通透部位的滅菌，如有些較細、較長的導管用其他低溫滅菌方法很難達到滅菌效果，而只能選擇EO或者輻照。

EO 滅菌對物品的損害也較小，滅菌是利用烷基化原理而非氧化過程，對不耐熱的材料及設備有著非常廣泛的應用前景。采用EO 滅菌時，可以用各種包裹材料包裹，便于儲存、運輸，打開包裝即可使用避免了交叉污染的危險，并且在滅菌過程中，有標準的化學、生物監(jiān)測手段，從而可以有效的控制滅菌質量。

EO 在臨床上有著廣泛的用途，采用EO 滅菌的設備及產(chǎn)品包括：

硬式和軟式內鏡，如：關節(jié)鏡、氣管鏡、膀胱鏡、胃鏡、腸鏡、眼底鏡、耳鏡、尿道鏡、胸腔鏡等等；

醫(yī)療設備，如：麻醉設備、人工腎、透熱設備、電線、表頭、心肺機、血透等；

儀器：電鉆、電燒器、牙鉆、顯微手術器、神經(jīng)刺激器、壓力計、外殼手術起、骨鉆、針頭、人工關節(jié)等；

橡膠制品：導管、擴張器、引流管、氣管內插管、手套、起搏器、心瓣膜、噴霧器等等。

2. 60Co-γ輻照滅菌法

上世紀50 年代末，各國紛紛建造大型的60Co-γ射線輻照源，用于商業(yè)化的輻照加工。從此60Co-γ射線滅菌技術的應用領域迅速擴展，從最初對一次性使用的醫(yī)療用品滅菌拓展到醫(yī)療器械材料滅菌、醫(yī)療藥品滅菌、食品滅菌保鮮、一次性生活用品滅菌、環(huán)境微生物污染治理等多個方面。

60Co-γ射線滅菌有很多的優(yōu)點，如不用做生物指示物(BI) 或產(chǎn)品的無菌實驗、在滅菌過程中溫度變化很小、射線可以到達器械管腔內部、滅菌后的產(chǎn)品不需要再處理，可以直接使用。但60Co-γ射線對高分子材料和包裝材料破壞性有一定的破壞作用，滅菌站對人和環(huán)境也存在污染的風險，因此60Co-γ射線的應用也受到了很大的限制。

2.1 滅菌原理

輻照技術是20 世紀發(fā)展起來的一種滅菌保鮮技術，是以輻射加工技術為基礎，運用X 射線、γ射線或高速電子束等電力輻射產(chǎn)生的高能射線，在能量的傳遞和轉移過程中，產(chǎn)生強大的物理效應和生物效應，達到殺蟲、殺菌、一直生理過程的目的。

其原理主要是破壞細菌細胞中的DNA 和RNA，受損的DNA 和RNA 分子發(fā)生降解，失去合成蛋白質和遺傳功能，使細胞死亡。60Co-γ頻率高到3×1018~3×1021Hz，其能量大于分子鍵能，故可使分子電離和斷鍵而殺菌。

其殺菌機理為60Co-γ射線直接破壞微生物的DNA、蛋白質和酶而致死，或者被微生物中的水吸收而激發(fā)或電力，產(chǎn)生激發(fā)的水分子、電子、水離子，或裂解為氫自由基、羥自由基，由此產(chǎn)生一系列的與DNA、蛋白質、酶的氧化還原反應，致微生物死亡。

2.2 滅菌驗證

輻照滅菌的驗證包括以下主要內容：

安裝確認：確認輻射源( 源的活性或加速器的參數(shù))、傳送系統(tǒng)、附屬設施( 包括相關的軟件)、計量裝置的計量狀態(tài)、工作環(huán)境的符合性進行驗證，如安全要求等。

操作確認：針對每個傳送系統(tǒng)，通過測量不同位置的吸收劑量驗證不同的輻照容器的計量分布，不同輻照容器以及容器內的不同位置的吸收劑量都在規(guī)定的范圍內。一般在加源后、源的位置及形態(tài)改變、傳送系統(tǒng)變化、輻照容器改變時都需要進行操作確認。

性能確認：包括物理性能確認和微生物性能確認。

物理性能確認包括確認產(chǎn)品放裝載模式、包括日常產(chǎn)品的包裝方式( 尺寸，密度等)，劑量分布、包括最大和最小吸收劑量及位置，產(chǎn)品的最大可吸收劑量( 評價滅菌劑量對產(chǎn)品的影響)。

微生物學性能驗證，目的是應書面證明在滅菌過程后，產(chǎn)品的無菌性能已經(jīng)達到特定的要求(SAL=10-6)。

2.3 產(chǎn)品放行

輻照滅菌的產(chǎn)品批次放行采用參數(shù)放行，不需要進行無菌實驗。通過放置在最大可吸收劑量點和最小可吸收劑量點的劑量計，檢測每批次滅菌的最大和最小劑量，最大和最小滅菌劑量在驗證劑量的范圍內，產(chǎn)品即可放行。

這一放行準則是基于定期的輻照滅菌劑量審核，審核內容一般涉及到生物負載限度、微生物特性分析、建立滅菌劑量的方法等。

2.4 應用

在使用60Co-γ射線滅菌時，不同菌種，甚至同一菌株的不同發(fā)育階段的抗輻射性均不同。一般來講，細菌的營養(yǎng)細胞抗輻射性弱，芽孢的抗輻射性強。同一種菌株在不同介質中的抗輻射性也是不同的。在有抗菌劑存在的條件下，大多數(shù)菌的抗輻射性增強，在缺氧條件下，菌種的抗輻射性也有所增強。一般來說輻照劑量大，滅菌效果好。但是輻照劑量過大，對樣品中的某些成分可能會有一定得影響，因此在具體的輻照實踐中需要確定輻照劑量。

由于γ射線本身的能量大、輻射強，對物質損害大，對輻射滅菌產(chǎn)品的材質有一定的要求。有些產(chǎn)品在滅菌后出現(xiàn)了材質的強度、清晰度、顏色、生物相容性以及包裝的完整性等方面的問題，有的是在輻射滅菌完成后不久便顯現(xiàn)出來，這主要是因為部分企業(yè)的產(chǎn)品特別是所用的包裝材料不適合輻射滅菌方式。

對于適合輻射滅菌的產(chǎn)品和材質的選擇，在GB18280-2000《醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌確認和常規(guī)控制要求輻射滅菌》的附錄A 中給出了器材材料和包裝材料的確認方法；在GB16352《一次性醫(yī)療用品γ射線輻射滅菌標準》的附錄C 中則較為詳細的列舉了適合輻射滅菌的醫(yī)療用品。

3. 高 壓 蒸 汽 滅 菌

高壓蒸汽滅菌是熱力消毒方法中最普遍、效果最可靠的一種滅菌方法，其優(yōu)點是蒸汽穿透力強，能殺滅所有微生物。

3.1 滅菌原理

高壓滅菌是濕熱消毒法的一種，其原理是：在密閉的蒸鍋內，其中的蒸汽不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋內溫度也隨之增加。

在0.1MPa 的壓力即103.4kPa(1.05kg/cm2) 蒸汽壓下，鍋內溫度達 121℃，維持15~30min。當溫度超過細胞最佳生理活動的溫度范圍時，細胞代謝減緩，細胞的蛋白質、酶及核酸會被永久性破壞，從而導致細胞發(fā)生不可逆轉的死亡。在此蒸汽溫度下，可以很快殺死各種細菌及其高度耐熱的芽孢，是最可靠、應用最普遍的物理滅菌法。

3.2 滅菌驗證

滅菌驗證一般分為以下幾部分內容。

安裝確認：一要確認滅菌器隨機文件和附件的完整性，如安裝記錄、圖紙、計算機軟件、計量裝置的校準( 溫度表、壓力表、時間計量表) 等；二要對滅菌器工作環(huán)境的符合性進行驗證，如水質檢測、安全要求等；三是要驗證滅菌器安裝是否符合設備安裝要求，確認滅菌劑的濃度及質量狀況。

操作確認：驗證滅菌設備有能力在指定的允差范圍內提供特定的過程，如熱分布試驗、包括空載熱分布試驗等。

性能確認：物理性能確認和微生物性能確認，包括滿載熱分布試驗( 最高最低溫度點)熱穿透試驗等，生物指示物的使用等。

3.3 產(chǎn)品放行

日常監(jiān)測中，需要監(jiān)測預處理時的溫度、整個滅菌過程的溫度和壓力等。最終只有生物指示物(BI) 培養(yǎng)全部顯陰性且滅菌過程參數(shù)在性能驗證的參數(shù)范圍內，產(chǎn)品才可以放行。

3.4 應用

由于高壓蒸汽滅菌本身具備不破壞產(chǎn)品表面并藥品、藥品溶液、玻璃器械、培養(yǎng)基等在高溫高濕條件下不發(fā)生變化或損壞的物質，均可以采用高壓滅菌法。

高壓蒸汽滅菌已經(jīng)被廣泛地應用到各種生化實驗室和醫(yī)院，用于一些培養(yǎng)基、玻璃制品、生理鹽水等的滅絕。

目前的高壓蒸汽滅菌器的類型和樣式較多，如：

①下排氣式壓力蒸汽滅菌器是普遍應用的滅菌設備，壓力升至102.9kPa(1.05kg/cm2)，溫度達121~126℃，維持20~30min，可達到滅菌目的。

②脈動真空壓力蒸汽滅菌器已成為目前最先進的滅菌設備。滅菌條件要求：蒸汽壓力205.8kPa(2.1kg/cm2)，溫度達132℃以上并維持l0min，即可殺死包括具有頑強抵抗力的細菌芽胞在內的一切微生物。

高壓蒸汽滅菌的注意事項：

(1) 必須先用流通蒸汽或真空排除滅菌器腔內空氣。若滅菌器內有空氣存在，則壓力表上所指示的壓力是滅菌器內蒸汽和空氣二者的總壓，結果壓力雖達到要求，但滅菌溫度卻達不到，達不到滅菌效果。

(2) 滅菌時間必須是從全部裝載的滅菌物均已達到滅菌溫度時開始計算。

(3) 裝載方式的確定，不同的裝載類型須驗證確認，避免隨意性。

(4) 高壓蒸汽滅菌器必須進行周期性驗證。

4. 甲 醛 蒸 汽 滅 菌

現(xiàn)代的低溫蒸汽甲醛滅菌(Sterilization by Low Temperature Steam Formaldehyde, LTSF) 方法，是上世紀60 年代發(fā)明的一種低溫滅菌技術，使用負壓低溫蒸汽甲醛法對一些怕熱怕濕的醫(yī)療器械進行滅菌。

4.1 滅菌原理

甲醛殺菌作用是阻止細菌核蛋白的合成，影響生物細胞漿基本代謝。一些研究指出，甲醛為強烷化劑，其殺菌原理是一種非特殊性的烷基化作用，甲醛分子直接作用于細菌的菌體蛋白質、酶以及核酸的活性基團，使蛋白質鏈上的氨基、壓氨基、羥基、羧基等烷基化，從而破壞細菌的蛋白質，導致微生物的死亡。

其中烷基化效應包括兩種作用：一是可降低水對蛋白質的穿透、彭潤作用，使其硬化；二是對核酸的烷基化反應，可導致病毒的滅活。

甲醛對細菌繁殖、芽孢、分枝桿菌、真菌和病毒等各種微生物都有高效的殺滅作用。甲醛對細菌病毒素亦有破壞作用，對肉毒桿菌素和葡萄球菌腸毒素，用50g/L 甲醛水溶液作用30min 可將其完全破壞。

4.2 滅菌驗證

無菌生產(chǎn)環(huán)境甲醛蒸汽滅菌驗證，驗證的目的為甲醛滅菌的時間、排風時間及效果驗證。確保無菌環(huán)境中用甲醛滅菌提供的空氣環(huán)境始終復合國家《藥品生產(chǎn)質量管理規(guī)范》對潔凈室中空氣浮游菌及表面細菌的規(guī)定。

在準備甲醛蒸汽滅菌的房間取樣點位置放入驗證裝置，指示物采用枯草桿菌芽孢。取樣點數(shù)量根據(jù)滅菌區(qū)域面積確定。在≤9m3的空間放置2 個取樣點，在小于14m3大于9m3的房間放置3 個取樣點，大于14m3的空間放置4 個取樣點。

在無菌生產(chǎn)環(huán)境中取樣點設置在分裝機罩內、出瓶轉盤、分裝間回風口、分裝間回風管、分裝機底部。在滅菌后進行取樣點菌片培養(yǎng)，將菌片接種于培養(yǎng)液中37℃培養(yǎng)至7d，若無菌生長則判斷滅菌合格。

目前國內對低溫甲醛蒸汽滅菌器功效檢驗尚沒有標準，對低溫甲醛蒸汽滅菌器的滅菌效果生物指示劑也沒有專門研究定標，因此這將影響低溫蒸汽甲醛滅菌技術的研究和推廣應用。

甲醛熏蒸法滅菌目前使用較少，驗證及產(chǎn)品放行準則可參照國際標準ISO 25424:2009。

4.3 應用

常溫常壓下使用甲醛熏蒸消毒主要利用化學法和加熱法產(chǎn)生甲醛氣體。將福爾馬林或多聚甲醛與某些強氧化劑如高錳酸鉀、氯制劑等發(fā)生化學反應，通過化學產(chǎn)熱促使甲醛氣化。加熱法是將福爾馬林或多聚甲醛直接用電加熱，使甲醛氣化進行熏蒸消毒。

有研究用每立方米120ml 福爾馬林與60g 高錳酸鉀混合反應產(chǎn)生甲醛氣體熏蒸1h，可使物體表面達到消毒，熏蒸75min 可使尿管達到有效消毒。甲醛熏蒸消毒后會殘留濃烈的甲醛刺激性氣味，可以采用化學中和法進行消除。在熏蒸消毒結束后，在熏箱底層放入一定量的濃氨水繼續(xù)熏蒸30min 可以降低刺激性氣味。

甲醛可用于對怕熱怕濕怕腐蝕的醫(yī)療用品的消毒與滅菌，可采用低溫蒸汽甲醛滅菌的器材主要有：

外科器械、包括導氣管、麻醉用具、關節(jié)鏡、心導管、腹腔鏡、膀胱鏡等；

診療器械有血氧合器、濕化器、注射器、呼吸機、乳膠導管、乳膠手套等；

電子器材有植入電極、變壓器、電位器、電容器、導線以及眼科手術使用的熱敏器材等。

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